(1) Miembro del grupo LeishVet. Facultad de Veterinaria, Universitat Autònoma de Barcelona.
(2) Miembro del Grupo de Estudio de la Leishmaniosis Canina (GSLC). Hospital Clínic Veterinari, Universitat Autònoma de Barcelona.

Entre las técnicas moleculares de análisis de ácidos nucleicos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), permite un diagnóstico de alta sensibilidad y especificidad, ya que amplifica fragmentos específicos de ADN. Se han identificado numerosos fragmentos amplificables de ADN de Leishmania y algunos de ellos han sido utilizados en técnicas de PCR para el diagnóstico de la leishmaniosis del hombre y del perro. Este capítulo intenta aclarar la utilidad para el clínico veterinario de la PCR en la leishmaniosis canina.

¿Son importantes las técnicas de diagnóstico molecular?

No hay ninguna duda en afirmar que el diagnóstico mediante técnicas moleculares ha cambiado el trabajo en la clínica veterinaria con las enfermedades infecciosas. La polymerase chain reaction (PCR) es la técnica molecular más desarrollada actualmente y tiene un amplio abanico de posibilidades, entre las que se incluyen la detección de diversos patógenos, la individualización de nuevos agentes infecciosos o el seguimiento de la prevalencia de diversas enfermedades infecciosas en la población. Probablemente, con la mejora progresiva de estas técnicas, la PCR llegue a sustituir a los diagnósticos más tradicionales como el cultivo en la evaluación de la leishmaniosis canina.

En los últimos 10 años se han desarrollado innumerables aplicaciones de la PCR en leishmaniosis canina. No obstante, desde el punto de vista clínico, la PCR se ha consolidado como un procedimiento realmente útil en la detección de la Leishmania que es difícil de visualizar.

¿En qué facetas de la clínica podemos aplicar la PCR?

La PCR se está aplicando en tres grandes campos:

• En el diagnóstico etiológico, donde la PCR es sobre todo útil en ausencia de métodos de diagnóstico alternativos o cuando éstos son muy complejos, para mejorar la eficacia diagnóstica complementando métodos convencionales o si se requiere un diagnóstico rápido y precoz del agente etiológico que permita iniciar el tratamiento específico lo antes posible.
• En el control del tratamiento, donde la PCR se utiliza tanto para la selección de los pacientes que deben ser tratados como para, una vez iniciado el tratamiento, comprobar su eficacia, para lo cual es importante disponer de métodos cuantitativos.
• En la caracterización genética del parásito (genotipificación) e identificación de mutaciones determinantes de resistencias a fármacos o de virulencia.

¿La serología pierde su valor en el diagnóstico de la leishmaniosis canina con la llegada de la PCR?

La serología es una de las técnicas más utilizadas en el diagnóstico de la leishmaniosis canina. Esta técnica nos informa del título de anticuerpos que ha producido el paciente frente a la presencia de la Leishmania. Suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, exudados o humor acuoso son las muestras clínicas más utilizadas.

Aunque su uso está muy extendido, puede ser difícil la interpretación de sus resultados. Los títulos normalmente son expresados en diluciones (1:80, etc.) o en porcentajes (150%, etc.). El problema principal es que la presencia de anticuerpos en un paciente es sólo circunstancial (puede significar que ha tenido contacto con el parásito anteriormente) y, por tanto, no podemos afirmar categóricamente que en ese momento el paciente está infectado. Un aumento de cuatro veces en el título basal se puede considerar diagnóstico para la leishmaniosis canina. A pesar de todo esto, el uso conjunto de la serología con la PCR aporta mucha más información que cada una por separado.

¿Qué es una PCR convencional?

Es la amplificación de un fragmento específico de ADN de la Leishmania en un tubo de ensayo donde se encuentra la muestra clínica. Es decir, permite detectar al agente infeccioso mediante la amplificación de su ADN. Sin embargo su resultado es sólo negativo (no se detectó el ADN del parásito) o positivo (se detectó el ADN del parásito).

	Se han desarrollado otros tipos de PCR que incluyen la PCR multiplex, la nested PCR y la PCR cuantitativa (qPCR): 1. La PCR multiplex permite la detección simultánea de varios ADN en la misma muestra. 2. La nested PCR realiza una doble amplificación (una PCR sobre el resultado de una PCR previa) con lo que se aumenta tanto la sensibilidad como la especificidad. 3. Finalmente, la PCR cuantitativa elimina la necesidad de hacer correr los fragmentos obtenidos en un gel para visualizarlos. La amplificación y la cuantificación del producto resultante se realizan al mismo tiempo en una única reacción. Es decir, nos permite decir que cantidad de parásitos hay en nuestro paciente. Además, parece que la PCR cuantitativa es algo más sensible y tiene menos riesgos de contaminación.

¿Cómo se realiza una PCR convencional?

El proceso de detección de la Leishmania por amplificación genética se desarrolla de manera habitual en tres etapas:

• La primera consiste en la extracción y purificación de los ácidos nucleicos del microorganismo de la muestra biológica, seguida de la amplificación de un segmento seleccionado del genoma del agente infeccioso mediante reacción en cadena de la polimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha. La PCR utiliza fragmentos cortos de ADN (oligonucleótidos) de cadena simple, llamados cebadores (primers), que corresponden a secuencias específicas de los extremos del ADN que se quiere amplificar.
• Después de la hibridación de los cebadores con el ADN molde, una polimerasa termoresistente cataliza el proceso de síntesis de la secuencia complementaria de nucleótidos. Este proceso se repite de forma exponencial durante 25-35 ciclos hasta obtener millones de copias de la secuencia de ADN original.
Finalmente, en la tercera etapa se lleva a cabo la detección de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, o mediante hibridación con sondas específicas. En general todo este proceso puede durar aproximadamente 24 h.

¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la PCR?

Las ventajas y desventajas de la PCR frente a otras técnicas diagnósticas se detallan en la siguiente tabla.

¿Por qué en la clínica se utiliza cada vez más la PCR cuantitativa?

Las ventajas de la PCR a tiempo real o cuantitativa (qPCR) son que permite una cuantificación de la carga de parásitos de la muestra (número de leishmanias), tiene una mayor sensibilidad que los otros tipos de PCR, permite el seguimiento y monitorización del tratamiento de los perros (incluso en aquellos con una baja cantidad de parásitos) y, además, existe mucho menor riesgo de contaminación durante la realización de la técnica (por tanto, evita los falsos positivos).

Es decir, no nos dice sólo si es positivo o negativo el resultado al final del proceso (a tiempo final), sino que nos da información durante el proceso de amplificación (cuantitativa) y si es positivo, nos da la cantidad de parásitos que presenta la muestra clínica (carga de parásitos baja, media o alta). En el seguimiento, la PCR cuantitativa nos permite tomar decisiones sobre la efectividad o no del tratamiento sin tener que esperar a obtener un resultado negativo en la muestra clínica, como sucede cuando se utiliza la PCR convencional.

¿Cómo debo interpretar los resultados de una PCR convencional?

Si la PCR es positiva, es muy probable que el perro tenga esa infección concreta (si la técnica se ha realizado con los controles adecuados). En la mayoría de los casos, la única manera de tener ADN de la Leishmania en la muestra es que el perro tenga una infección activa. Si la PCR es negativa, sólo significa que el ADN del parásito no está presente en la muestra que se ha analizado, pero eso no significa que la Leishmania no está en el perro del cual se ha tomado la muestra.

Se debe recordar que muchas PCR sólo evalúan de uno a 10 microlitos de sangre o muestra clínica equivalente. Además, el valor predictivo negativo de una PCR sólo se puede saber si la prueba se ha realizado en una población de perros en los que se conoce la prevalencia real de esta enfermedad. Desafortunadamente esto no es posible en la mayoría de las PCR comercializadas o realizadas por los laboratorios.

¿Cómo debo interpretar los resultados de una PCR cuantitativa?

La interpretación de una PCR cuantitativa para el diagnóstico de la leishmaniosis es esencialmente la misma que para la PCR convencional. Sin embargo, hay diferentes datos publicados que demuestran que tiene una mayor sensibilidad comparada con la PCR convencional. La mayor utilidad de la PCR cuantitativa es la cuantificación de los parásitos ya que no nos dice únicamente si la Leishmania está presente o no, sino que nos dice si está presente en mucha o poca cantidad. Además, saber la cantidad de parásitos de la muestra nos permitirá evaluar de una forma más clara la respuesta al tratamiento y, posiblemente en el futuro, dar un pronóstico sobre la evolución de la enfermedad.

En la leishmaniosis canina, ¿cómo puede ayudar más al clínico la PCR cuantitativa frente a la PCR convencional?

Las manifestaciones clínicas de la leishmaniosis canina varían enormemente debido a los numerosos mecanismos patogénicos que engloba la enfermedad, así como a la gran diversidad de respuestas inmunes que muestran los distintos huéspedes frente al parásito. En la clínica diaria, los veterinarios se enfrentan a casos compatibles con leishmaniosis y a menudo con resultados contradictorios en las diversas pruebas diagnósticas. El resultado de una PCR convencional es una variable discreta con dos posibles valores (positivo o negativo) e incluso muestras con diferencias en la carga parasitaria de hasta cinco órdenes de magnitud dan el mismo resultado positivo en la PCR convencional. Conviene considerar:

1) Que todas las muestras sometidas a un análisis de Leishmania por PCR provienen de perros con signos clínicos o alteraciones en la analítica compatibles con la enfermedad.
2) Que los signos clínicos o las alteraciones en la analítica de la leishmaniosis canina son diversos, inespecíficos y compatibles, en muchos casos, con otras patologías.
3) Que en una zona endémica se pueden encontrar perros con serologías dudosas que pueden estar infectados por el parásito pero sin tener la enfermedad activa.
4) Que la PCR cuantitativa “qPCR” es capaz de discriminar de 0.01 a 10.000 parásitos en una reacción.

El valor continuo de los datos que se obtienen con la qPCR puede ayudar al veterinario clínico a dilucidar el estatus de perros positivos por PCR convencional, especialmente en zonas endémicas, diferenciando entre infección o enfermedad activa y tomando la decisión final de tratar o no al perro. A su vez, la qPCR es muy útil en la monitorización de la enfermedad. Los perros que son positivos por PCR convencional en todos los puntos del análisis, pueden mostrar drásticas diferencias en la carga parasitaria, por tanto, no hay que esperar a ser negativo por PCR convencional para validar la efectividad del tratamiento.

En conclusión, dado que la qPCR permite cuantificar de forma precisa la carga parasitaria, resulta una ayuda eficaz para poder confirmar un diagnóstico de leishmaniosis en casos de serología dudosa o incluso cuando el perro aún no ha seroconvertido. En casos de qPCR positivas se recomienda repetir la prueba al mes postratamiento para evaluar la respuesta al mismo, a los seis meses si ha negativizado y anualmente de forma preventiva. Si no responde al tratamiento se puede repetir la qPCR a criterio del clínico para monitorizar la evolución del parásito y/o evaluar la presencia de otras coinfección o enfermedades. Para perros sin signos clínicos y control rutinario se pueden hacer qPCR de sangre/frotis conjuntival una vez al año.

¿Existen falsos positivos en la PCR?

Los falsos positivos (la prueba es positiva pero la Leishmania no está presente en el perro) pueden ocurrir por varios motivos. En el diagnóstico clínico, la causa más frecuente es la contaminación, cuya fuente más común son las amplificaciones resultantes de las PCR realizadas previamente en el laboratorio. Los controles meticulosos sobre la separación física entre las muestras anteriores y posteriores a la amplificación son los que caracterizan la buena práctica de un laboratorio. Estos controles reducen la posibilidad de contaminación en un grado importante.

También pueden darse falsos positivos cuando los cebadores (primers) que se utilizan no se han seleccionado meticulosamente y, por tanto, detectan y amplifican otra secuencia de ADN distinta a la deseada.

¿Existen falsos negativos en la PCR?

Los falsos negativos (la prueba es negativa pero la Leishmania está presente en el perro) pueden ocurrir con la PCR en los casos en que el volumen de la muestra es demasiado pequeño o cuando existen problemas en su procesado. Si se sospecha que la concentración del parásito es muy baja, el laboratorio debe usar métodos para concentrar o purificar la muestra antes de iniciar la PCR. Las causas más frecuentes de problemas en el procesado de la muestra son la inadecuada eliminación de inhibidores de la PCR (como hemoglobina, medicamentos o formol, entre otros) y la baja cantidad y calidad de la extracción de ADN de las muestras.

¿Qué muestras podemos enviar para realizar una PCR?

La amplificación del ADN se puede realizar sobre casi cualquier muestra o material clínico obtenido, como sangre o médula ósea (conservadas en EDTA o citrato), ganglio linfático, saliva, orina, LCR, humor acuoso, exudados, raspados cutáneos o conjuntivales y biopsias de diferentes tejidos u órganos (frescas o parafinadas).

Las muestras no se deben conservar o enviar en heparina o en formol porque inhiben la PCR y, por tanto, los resultados pueden ser negativos. Lo más importante es preservar el ADN y por tanto las células. Por eso, no hace falta enviar las muestras refrigeradas pero si lo antes posible, especialmente si es sangre o médula ósea. La hemólisis es un factor importante de interferencia con la PCR. Si se ha de retrasar el envío de las muestras, éstas se pueden mantener refrigeradas o congeladas. No hace falta que las muestras sean estériles, siempre y cuando no existan otros microorganismos que se amplifiquen con la misma técnica. Esta última circunstancia supondría un falso positivo como resultado final.

Tanto en Medicina como en Veterinaria se ha podido detectar ADN de Leishmania en raspados y biopsias de piel en casos en los que las técnicas convencionales no habían sido capaces de identificar el parásito, incluso en muestras conservadas en parafina durante años. Lo más importante es seleccionar la muestra a analizar de donde sea más probable encontrar al agente infeccioso. Por ejemplo, numerosos estudios realizados en el hombre y en el perro demuestran una sensibilidad y especificidad muy altas de la PCR (alrededor del 100%) en la detección de Leishmania en la médula ósea. Sin embargo, en las muestras de sangre la sensibilidad baja y varía según los autores entre 60 y 80%.

Finalmente, no hay que olvidar que la PCR cuantitativa permite cuantificar cargas de patógenos muy bajas y, por tanto, utilizar la sangre periférica como muestra válida para el diagnóstico de la leishmaniosis canina.

En la leishmaniosis, ¿cuál es la mejor muestra clínica para el diagnóstico o el seguimiento mediante PCR?

La elección de la muestra para el diagnóstico o seguimiento de un perro con leishmaniosis es una decisión clínica. El veterinario debe decidir en cada caso cuál es la muestra clínica más eficaz, ya que debido al tropismo variado que exhibe el parásito frente a los distintos tejidos, la cantidad de parásito es diferente y oscila. Por ejemplo, la carga parasitaria puede ser de 4.000 a 5.000 veces más en un aspirado de médula ósea que en sangre periférica.

Debido a esto, el veterinario debe variar el tipo de muestra en función de cada caso y de lo que quiera valorar en esa PCR. Si lo que se quiere es hacer un diagnóstico, hay que seleccionar la muestra clínica donde creamos que vamos a encontrar más leishmanias:

• Si el cuadro clínico es marcadamente cutáneo o muco-cutáneo (nódulos, pápulas, ulceras, fístulas, alopecias con descamación, hipopigmentación, etc.) las mejores muestras serían las biopsias de estas lesiones o el aspirado de médula ósea por este orden.
• Si el cuadro clínico es más heterogéneo, probablemente el aspirado de médula ósea, la sangre periférica o el aspirado de ganglio, por este orden, podrían ser las muestras clínicas de elección.

Algunos veterinarios realizan una mezcla de sangre y aspirado de médula ósea (muchas veces se obtiene poca cantidad) como muestra para realizar la PCR ya que de esta manera aumentan las posibilidades de detección del parásito.

Como los cuadros clínicos asociados a la leishmaniosis son tan variados, en los casos en los que las lesiones estén circunscritas sólo a mucosas, ojos, articulaciones, hueso, intestino, músculo, tejido subcutáneo, uñas, etc., las biopsias de cada una de estas lesiones serán las mejores muestras clínicas para realizar la PCR. Sin embargo, la capacidad de la qPCR para cuantificar cargas parasitarias muy bajas permite a su vez utilizar la sangre periférica (debido a su fácil obtención) como muestra válida tanto para el diagnóstico de la leishmaniosis en muchos de los casos como para el seguimiento durante el tratamiento.

Si se ha enviado una muestra de sangre periférica para el diagnóstico de la leishmaniosis mediante PCR y el resultado ha sido negativo, y seguimos pensando que el cuadro clínico es muy sugestivo de leishmaniosis, se debe enviar otra muestra de aspirado de médula ósea sólo o mezclado con sangre periférica para aumentar las posibilidades de detección del parásito.

	Estas serían algunas de las preguntas que habría que hacerse antes de seleccionar un laboratorio para realizar las PCR: a) ¿Cómo estás de familiarizado con el laboratorio y con las pruebas diagnósticas que realizan? b) ¿El personal del laboratorio ha publicado resultados de las investigaciones o de las validaciones de sus pruebas diagnósticas? c) ¿Tiene el laboratorio algún experto que te pueda responder a las dudas sobre la enfermedad o sobre los resultados de las pruebas? ¿O sólo es un laboratorio de biología molecular sin experiencia en las enfermedades y patógenos que tienen los perros y gatos? d) ¿El laboratorio ha escrito y sigue unas normas tanto de procedimiento como de calidad de la PCR? e) ¿La PCR que ofrece el laboratorio suena a tan perfecta que parece que no pueda ser verdad? f) ¿Tiene sentido (en tu caso clínico) realizar la prueba que te ofrecen? Por ejemplo, buscar la Leishmania mediante una PCR en sangre. Si después de hacerte esta preguntas sobre un laboratorio tienes dudas, busca otro laboratorio. No todas las PCR se han desarrollado igual, por tanto, hay que evaluar diferentes cuestiones sobre la técnica antes de elegir el laboratorio donde se realizará la PCR.

¿Es la PCR la solución definitiva a todas las dificultades en el diagnóstico de la leishmaniosis canina?

La respuesta es NO.

No existe una estandarización de las PCR entre los diferentes laboratorios, lo que significa que no se pueden comparar directamente los resultados de unos con otros. Cuando hay discrepancias entre los resultados es imposible decir quién es el que tiene razón. Por tanto, es muy importante la selección de un laboratorio en el que confiemos y siempre realizar las PCR allí. Sin embargo, no debemos olvidar que no hay una técnica de diagnóstico 100% sensible y especifica.

Los resultados de todas las pruebas se deben interpretar junto con toda la información que dispongamos del paciente; el diagnóstico de una enfermedad infecciosa es una decisión clínica, no sólo un positivo en una determinada prueba de laboratorio.

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